1. 如果分離不含還原糖(如下文所示)的糖類或含糖化合物,請遵循前文的一般建議。
2. 如果分離還原糖,請查看以下信息。
3. 還原糖可以發(fā)生變旋,導(dǎo)致α環(huán)與β環(huán)形式的糖(差向異構(gòu)體)產(chǎn)生,這是一種不良分離。
4. 升高溫度和pH值可使差向異構(gòu)體合并成一個(gè)峰:
5. 在35 ℃下使用高pH(0.2%三乙胺(TEA)或0.1%氨水(NH4OH))和/或
6. 在高溫下(> 80 ℃)使用0.05% TEA (>80 ℃)。
7. 分離還原糖(例如果糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、阿拉伯糖、甘油醛等)時(shí),請注意遵循以下建議。否則會(huì)導(dǎo)致這些分析物出現(xiàn)分裂峰(差向異構(gòu)體分離):
a. 以低流速運(yùn)行(例如,在2.1 x 50 mm色譜柱上流速設(shè)置為0.10~0.13 mL/min),促進(jìn)差向異構(gòu)體峰合并。
b. 色譜柱較長時(shí),可采用較高的流速(例如0.3 mL/min)。和所有LC分離一樣,理想流速應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)來確定。
c. 向兩個(gè)流動(dòng)相(例如A2、B2等)儲(chǔ)液瓶中加入三乙胺(TEA)或氨水(NH4OH)改性劑。
d. 對于單糖和/或二糖的UPLC/ELSD分離,典型的等度UPLC條件包括:
i. 含有0.2% TEA的75%乙腈(ACN),35 °C,0.13 mL/min,2.1 x 50 mm BEH Amide色譜柱;
ii. 含有0.05% TEA的77%丙酮,85 °C,0.15 mL/min,2.1 x 50 mm BEH Amide色譜柱;
iii. 含有0.2% TEA的75% ACN,35 °C,0.2 mL/min,2.1 x 100 mm BEH Amide色譜柱。
e. 對于更復(fù)雜的糖類混合物(例如多糖)的UPLC-ELSD分離,典型的梯度UPLC條件包括(流動(dòng)相A和B中都需要添加TEA):
i. 10 min內(nèi)梯度從80%變化至50% ACN(含0.2% TEA),35 °C,0.13 mL/min,2.1 x 100 mm BEH Amide色譜柱,或使用2.1 x 150 mm BEH Amide色譜柱(流速升至0.3 mL/min);
ii. 10 min內(nèi)丙酮從80%變化至55%(含0.05% TEA),85 °C,0.15 mL/min,2.1 x 100 mm BEH Amide色譜柱。
f. 對于單糖和二糖的UPLC-MS分離,典型的等度UPLC條件包括:
i. 75%ACN + 0.1% NH4OH,35 ℃,0.13 mL/min,2.1 x 50 mm BEH Amide色譜柱。
g. 對于更復(fù)雜的糖類混合物(例如多糖)的UPLC-MS分離,典型的梯度UPLC條件包括(流動(dòng)相A和B中都需要添加NH4OH):
i. 10 min內(nèi)梯度從75%變化至45%ACN(含有0.1%NH4OH),35 °C,0.2 mL/min,2.1 x 100 mm
BEH Amide色譜柱。
6. 更復(fù)雜的樣品混合物可能需要使用梯度條件和/或更長的UPLC色譜柱。
7. 如果在一種或多種流動(dòng)相中使用了丙酮,請勿使用丙酮作為樣品稀釋劑或針清洗溶劑。有關(guān)樣品稀釋劑建議和針清洗溶劑/灌注溶劑建議的其他技巧(#3),請參閱進(jìn)樣溶劑部分。
8. 含糖/多糖/碳水化合物時(shí),典型樣品前處理建議如下:
a. 液體樣品
i. 使用50:50 ACN/H2O稀釋。
ii. 使用0.45μm或0.22μm針式過濾器過濾(如有必要)。
b. 固體樣品
i. 稱取約3g樣品放入50 mL離心管中。
ii. 加入25 mL 50:50 ACN/H2O,混合均勻(機(jī)械混勻)。
iii. 在3200 rpm下離心30 min。
iv. 收集上清液,使用0.45μm或0.22μm針式過濾器過濾(如有必要)。
c. 視樣品和/或分析物濃度而定,可能需要對樣品進(jìn)行額外稀釋。
d. 更復(fù)雜并且/或者分析物濃度更低的樣品可能需要額外的樣品前處理步驟(例如固相萃取(SPE))。
e. 考慮使用VanGuard BEH Amide保護(hù)柱保護(hù)UPLC色譜柱。
f. 建議通過在工作流程中加入HILIC質(zhì)量控制(QC)參比物質(zhì)來監(jiān)控系統(tǒng)的運(yùn)行狀況。